Cas12a Nuclease

产品简介

CRISPR–Cas12a蛋白（又称Cpf1 ），是一种原核脱氧核糖核酸酶，可以通过向导RNA进行编程，以靶向互补的DNA序列。与靶DNA结合后，CRISPRCas12a蛋白在每条靶DNA链中诱导切割，产生双链DNA断裂。除了诱导靶DNA的顺式切割之外，靶DNA结合还诱导非靶DNA的反式切割。

产品信息

产品用途

1. 利用Cas12a对DNA检测信号放大，应用于实时荧光法和胶体金法检测。

2. 利用Cas12a筛选crRNA，通过CRISPR实现基因的敲除/敲入。

产品质控

RNase残留检测：2μg本酶与293T Cell RNA 37℃ 孵育30 min，经琼脂糖凝胶电泳，RNA电泳图谱未发生变化。

核酸内切酶残留检测：2μg本酶与0.3μg 载体37℃ 孵育4 h，经琼脂糖电泳，质粒电泳谱带不发生变化。

核酸外切酶残留检测：2μg本酶与50pmol单链DNA底物和双链DNA底物37℃孵育16 h，经非变性PAGE电泳，DNA的电泳谱不发生变化。

大肠杆菌DNA残留检测：0.5μg本酶中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan qPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。

实验步骤

A.使用Cas Nuclease体外切割DNA操作方案：

1. 按顺序配置反应体系（30μL）：

注意事项：

Ⅰ 一般使用30ul体系。但也可等比例放大；

Ⅱ 实验前请使用无核酸酶的水将crRNA稀释到300nM；

Ⅲ 请佩戴口罩并使用无核酸酶的耗材与试剂，避免实验过程crRNA的降解。

2. 37℃孵育10min

3. 加入3ul 30nM的靶标DNA（使用无核酸酶的水稀释）

4. 震荡混匀并短暂离心收集

5. 37℃孵育30 min，75℃灭活15min

6. 反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析

B.使用Cas Nuclease荧光检测操作方案

1. 按顺序配置反应体系（50μL）：

注意事项：

Ⅰ 一般使用50ul体系。但也可等比例放大；

Ⅱ 实验前请使用无核酸酶的水将crRNA稀释到1μM；

Ⅲ 请佩戴口罩并使用无核酸酶的耗材与试剂，避免实验过程crRNA的降解。

2．避光条件下，转移至荧光定量PCR仪

3．反应程序，37℃ 5s ；40℃ 40s收集荧光1次 20个循环；4 ℃ 10s

4．反应结束观察荧光判定结果

注意事项

1. 实验中，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 Nuclease-free。

2. Cas12a Nuclease 对热敏感，应全程冰上配置体系，在使用后立即将酶置于-20℃保存。

3. 实验中，sgRNA 很关键，可以根据 target DNA 选择最佳的 sgRNA 序列。重视 sgRNA 的保存，防止降解失效。

常见问题及解决方案

为什么观察到条带切割不完全？

1. 为了保证最高的切割效率，Cas12a Nuclease和crRNA与target DNA的摩尔比例至少为10:10:1或者更高。

2. 可能与crRNA的序列有关，可以根据target DNA选择最佳的crRNA序列；

3. 可能由于crRNA降解引起的，可以通过凝胶电泳验证crRNA完整性。