文献分享之新型CAR-T制备平台: MEGA

一、主要研究内容

CAR-T 细胞疗法已经彻底改变了癌症治疗格局，特别是在治疗血液类癌症方面。随着基于 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的发展，下一代基因工程 T 细胞疗法展示了潜在的癌症治疗效果。然而，CRISPR-Cas9 的基因编辑系统在安全性、有效性和更广泛应用方面仍然存在限制。Cas9核酸酶及碱基编辑器对T细胞基因组的永久性改变以及潜在的基因毒性副作用是目前的挑战之一。在此背景下，该研究开发了一种基于 CRISPR-Cas13d 的多重 RNA 编辑平台，MEGA (Multiplexed Effector Guide Arrays)，用于原代人 T 细胞的多重转录调控和代谢工程。该研究开发了多重效应物导向阵列，这是一个可编程和可扩展的平台，利用 CRISPR-Cas13d 的 RNA 引导、RNA 靶向活性在转录组水平调控 T 细胞。MEGA 可以在人原代 T 细胞中实现定量、可逆和大规模的基因敲低，而无需靶向或切割基因组 DNA。研究人员将 MEGA 应用于 CAR-T 细胞耗竭模型，通过组合 CRISPR 筛选稳健地抑制了抑制性受体的上调，并发现了T细胞功能的配对调节因子。此外，该研究还实现了通过 FDA 批准的药物甲氧苄啶调控 MEGA 来以受体非依赖的方式控制 CAR 激活。最后，MEGA 实现了免疫调节代谢通路的多重阻断，以增强 CAR-T 细胞的体外和体内适应性和抗肿瘤活性。

1. 开发定向编辑RNA工具，MEGA。MEGA靶向T细胞转录组的调控，具有快速、可调节和可逆性。

2. MEGA HA-28z CAR T细胞强有力地抑制T细胞免疫抑制检查点LAG3, PD-1, TIM3的表达。

3. 将 MEGA 应用于 CAR-T 细胞耗竭模型，通过组合 CRISPR 筛选稳健地抑制了抑制性受体的上调，并发现了T细胞功能的配对调节因子；

4.通过组合药物甲氧苄啶与MEGA，以受体非依赖的方式控制 CAR 激活。实现了免疫调节代谢通路的多重阻断，以增强 CAR-T 细胞的体外和体内适应性和抗肿瘤活性。

二、文章亮点

1. MEGA可在原代人类T细胞中进行大规模多重RNA敲低；

2. MEGA组合敲低筛选鉴定了CAR T细胞功能的成对调控因子；

3. MEGA与甲氧苄啶组合，进行可调节和可逆转的多基因调控。

4. 代谢工程增强了CAR T细胞在体内的适应性和抗肿瘤活性。

三、思考

目前的CAR-T细胞，包括此文章种的MEGA技术，主要作用于血液瘤，而实体瘤的免疫细胞治疗仍困难重重。主要受到以下要点的困扰：(1) 实体瘤缺乏有效靶点。与血液肿瘤的靶点大多单一且具有特异性不同，实体瘤中肿瘤特异性抗原 (TSA) 很少，目前发现的肿瘤高表达的抗原多为肿瘤相关抗原 (TAA)，在正常组织中也有表达。这就带来了很高的脱靶风险，安全性成为关键问题；(2) CAR-T的转运和浸润，实体瘤具有干扰T细胞转运进行免疫逃逸的机制。一方面，与血液肿瘤细胞呈分散状不同，实体瘤往往形成坚实的团状物，加上丰富的肿瘤相关成纤维细胞 (CAF) 和血管，形成了一层天然的物理屏障。另一方面，一些实体瘤会抑制某些趋化因子的分泌。趋化因子与其受体的相互作用会促进T细胞向肿瘤微环境的迁移。同时，CAR-T细胞表面也缺乏与实体瘤分泌的趋化因子相匹配的相关受体，造成CAR-T对肿瘤部位的归巢能力差；(3) 肿瘤微环境的免疫抑制。肿瘤微环境 (TME) 中低pH、低氧、高渗透，同时存在免疫抑制机制，极不利于T细胞的存活和发挥免疫效力。TME中存在免疫抑制细胞，如调节性T细胞 (Treg)、骨髓源异质性细胞 (MDSC) 和M2型巨噬细胞。这些免疫抑制细胞在实体瘤内会释放转化生长因子β (TGFβ) 和白细胞介素-10 (IL-10) 等细胞因子，降低回输后CAR-T的抗肿瘤效果。(4) 内源性T细胞抑制信号。T细胞的免疫活性存在内源性调节机制，当T细胞过度活跃时，PD-1和CTLA4等分子发挥作用，维持免疫平衡。在CAR-T细胞被抗原激活后，PD-1和CTLA4与相关配体相结合，抑制T细胞的增殖和相关细胞因子的分泌。因此，内源性T细胞抑制信号也会降低CAR-T的抗肿瘤活性。

基于目前实体瘤的治疗瓶颈，CPP高效递送细胞的功能，可能会有助于解决实体瘤治疗限制点 (2) “CAR-T的转运和浸润，实体瘤具有干扰T细胞转运进行免疫逃逸的机制。”