SpCas9快速基因编辑试剂盒

产品简介

本产品为自主研发的高效、快速型基因编辑试剂，其主要组分为SpCas9-GFP融合蛋白与Assist Reagent辅助试剂。此快速基因编辑试剂无需转染试剂，通过添加SpCas9-GFP蛋白与Assist Reagent的混合液至细胞中，30 min后即可通过荧光检测SpCas9进入细胞的效果。使用者可混合RNP (SpCas9-GFP与靶标sgRNA孵育) 与Assist Reagent后添加至细胞，亦可添加SpCas9-GFP蛋白与Assist Reagent的混合液于表达sgRNA的细胞中，实现靶标基因编辑。

产品信息

产品优势

1. 普适性：适用于各种细胞系类型 (包括原代细胞) 的快速基因编辑。

2. 快速性：方便快捷，无需转染试剂，将SpCas9-GFP与Assist Reagent混合后，直接添加到细胞中孵育30 min即可完成SpCas9-GFP的递送，用于开展后续实验。

实验步骤

以递送RNP为例：

A. RNP制备 (推荐制备流程，可自行调整)

1. Dissolve sgRNA powder

使用无菌dPBS (-Ca²⁺，-Mg²⁺) 溶解sgRNA冻干粉至终浓度30 μM，保持无菌操作。

2. Refold sgRNA

sgRNA 溶解后，盖好盖子 → 金属浴70 ℃，5 min → RT (室温) ，5 min → 在生物安全柜中加入MgCl₂ (MgCl₂终浓度为1 mM，保持无菌)→ 金属浴50 ℃，5 min → RT，5 min → 冰上静置待使用 →长期保存于-80 ℃ (全程保持无菌操作) 。

B. 细胞实验 (以24孔板为例)

SpCas9-GFP和Assist Reagent冰上解冻后用于后续过程。

1. Incubate RNP

(1) 将SpCas9-GFP缓慢加到等体积的sgRNA (比如一个实验孔，10 μL SpCas9-GFP加到10 μL 30 μM sgRNA中，需要的RNP体积总量根据实验设计定，准备每种RNP的量应多于实验所需量，避免损耗导致的实验量不够)。

(2) 混合后的RNP在室温孵育15-20 min，孵育时间不超过半小时。

注：将SpCas9-GFP加入sgRNA，顺序不可颠倒，否则蛋白会沉淀，无法使用！

2. Incubate RNP with Assist Reagent

RNP孵育结束后，将RNP与Assist Reagent以体积比为2:1混合，以每孔终体积为400 μL液体为例，推荐实验量如下：

(1) 准备细胞：8×10⁵ cells in 370 μL无血清1640或Opti-MEM；

(2) RNP/Assist Reagent制备：20 μL RNP + 10 μL Assist Reagent；

(3) 若需要无Assist Reagent的单独RNP对照组，则应加入20 μL RNP + 10 μL 无血清1640或Opti-MEM) 。

3. 实验操作：

以上细胞和RNP或RNP/Assist Reagent准备结束后：

(1) 用RNP或RNP/Assist Reagent孵育细胞30min或孵育过夜，孵育条件为无血清1640或Opti-MEM；

(2) 用含有2% FBS的PBS清洗细胞1-2遍；

(3) 用完全培养基培养细胞2-3天后收集细胞，并进行后续实验操作。

如果递送到表达sgRNA的细胞，则只需将10 µL SpCas9-GFP和10 µL Assist Reagent加到380 µL无血清1640或Opti-MEM，37 ℃孵育细胞30 min，即可进行后续实验操作。

注意事项

1. 本试剂盒主要成分为SpCas9-GFP，若要进行基因编辑，需要自己完成表达sgRNA细胞的构建，也可以合成sgRNA后制备RNP孵育细胞。

2. 处理贴壁细胞，更换液体时请小心吸出上清。

3. RNP的递送，先制备RNP，再和辅助试剂混合后添加，注意先后顺序！